МИХАИЛ АБОЛМАЗОВ, АНДРЕИ ТИМОФЕЕВ, наши спецкоры
«Внерибосомный этап реализации генетичесного кода» — так называется работа, за которую шесть молодых ученых из Москвы и Новосибирска получили премию Ленинского комсомола 1984 года. Сергей Берестень, Малик Нурбенов и Игорь Мадоян проводили работу в Москве, в Институте молекулярной биологии АН СССР, Евгений Невинский, Нина Моор и Инна Горшкова — в Новосибирском институте биоорганической химии СО АН СССР. Все шестеро завершили свои исследования защитой кандидатских диссертаций. Объект изучения — ферменты, вещества, без которых в живой клетке не проходит ни одна химичесная реакция.
Я убеждаюсь, что дождался часа.
Когда природы тайную печать
Нам удалось сознательно сломать
Благодаря пытливости привычной.
Около 30 лет назад на стыке химии, физики и биологии возникла новая наука — молекулярная биология. Начальный этап ее развития был отмечен рядом блистательных открытий. Определение структуры и биологической функции дизоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), всех типов рибонуклеиновых кислот (РНК), рибосом (самых маленьких клеточных органелл), а также установление их роли в передаче генетической информации, открытие явления обратной транскрипции — синтеза ДНК на матрице РНК, выявление механизмов биосинтеза белков, структуры антител — главных защитников организма, биологический и химический синтез гена, в том числе человеческого, перенос генов из одного организма в другой, расшифровка химического строения большого числа индивидуальных белков, главным образом ферментов, а также нуклеиновых кислот — вот далеко не полный перечень достижений молодой науки. Сейчас в ее развитии наступил внешне спокойный период. Настало время углубленных исследований, проникновения а самые потаенные уголки человеческого организма.
Самым сложным химическим процессом, происходящим в клетке, является синтез белков. Он происходит в рибосомах — «фабриках» белка. Производительности рибосом может позавидовать любой завод: за час они синтезируют белка больше, чем весят сами. Сюда образующаяся на ДНК так называемая «матричная» РНК (мРНК) приносит из ядра клетки генетическую информацию, которую с нее, как с магнитофонной ленты, считывает еще одна РНК — «транспортная» (тРНК). Она приходит в рибосому, чтобы руководить сборкой белка, причем с ней предварительно соединяется определенная аминокислота. Если последняя «ошибется» и соединится не со «своей» тРНК, синтез белка пойдет по неверному, запрограммированному пути. Из 20 тРНК, существующих в клетке, аминокислота «выбирает» нужную ей с помощью фермента — синтетазы. Он не только «узнает» тРНК, но и способствует ускорению реакции соединения с ней аминокислоты в сотни тысяч раз, то есть выступает в роли катализатора. Этот процесс, происходящий в цитоплазме клетки и называемый внерибосомным этапом передачи генетического кода, с момента зарождения молекулярной биологии является одним из главных объектов исследований ученых. В последнее время особое их внимание сосредо-
точено непосредственно на ферментах, выявлении механизма действия, а также структуры этих сложных биополимеров.
— Познав, как работают ферменты, — поясняет руководитель новосибирской группы лауреатов, академик Дмитрий Георгиевич Кнорре, — мы научимся использовать их для проведения реакций, которых нет в природе, а на этой основе сможем создавать новые химические производства.
Москвичи и новосибирцы исследовали именно эти ферменты-синтетазы. То была совместная работа по совместной программе, во время которой шел активный обмен мнениями, идеями, научными материалами. Каждый ее участник отвечал за свой конкретный участок.
Известно, что на поверхности фермента, который является сложной белковой молекулой, имеются активные центры. В них к ферменту присоединяются различные вещества: в одном — тРНК, в другом — аминокислота, в третьем — аденозинтрифосфорная кислота (АТФ), которая при своем расщеплении поставляет энергию, необходимую для образования химической связи между первыми двумя веществами. Соединившись, тРНК и аминокислота уходят из фермента в рибосому, причем, как говорят биохимики, «не оставляя следов» на его поверхности — структура фермента совершенно не изменяется. В этом кроется главная причина того, что обнаружить, где находятся его активные центры, чрезвычайно трудно. Поиском их месторасположения занимались новосибирцы: Евгений Невинский, Нина Моор и Инна Горшкова. Для этой цели они сконструировали специальные химические инструменты — синтезировали так называемые афинные реагенты, вещества, сходные по структуре и свойствам с природными биополимерами, например с тРНК или аминокислотой, но имеющие в отличие от них в своем составе какую-либо химически активную группу. Подобные реагенты можно получить либо непосредственно из природных веществ, присоединив к ним такую группу, либо создать новое химическое соединение — «двойника» природного, чтобы фермент не принял его за «чужака». Молодые исследователи синтезировали десятки подобных реагентов, использовали их для изучения механизма работы ферментов, в частности для обнаружения активных центров. Поскольку фермент по своим свойствам и структуре очень незначительно отличается от других находящихся в клетке белков, его невозможно изучать непосредственно в ней, а значит, надо выделить в чистом виде. Для этого применялись известные в настоящее время методы. Сначала клетки разрушали путем очень тщательного измельчения тканей, переводили фермент в раствор, а последний очищали с помощью электрофореза (способ, основанный на одном из важнейших свойств белковых молекул — наличии на их поверхности электрических зарядов), а также гель-фильтрации (просеивание через молекулярные сита).
Как же проходила операция выявления активных центров? Прежде всего на бумаге «сочинялась» структура будущего афинного реагента, затем его синтезировали. Скажем, к молекуле АТФ присоединяли химически активную группу, которая образует с ферментом прочную химическую связь — как бы «цепляется» за строго определенное место на его поверхности. Таким образом фиксируется центр присоединения молекулы АТФ — активный центр фермента. Точное его расположение можно определить с помощью меченых атомов.
Используя афинные реагенты, новосибирцам удалось установить, каким образом распределены активные центры одной из синтетаз, фермента, состоящего из двух субъединиц — двух цепей белковых молекул. На этом сложном ферменте Евгений Невинский обнаружил, помимо известных трех центров, еще один — регуляторный, управляющий их действиями. Каким образом он осуществляет свою регуляторную деятельность — предстоит решить в последующих работах.
Не менее интересное наблюдение сделала Инна Горшкова. Проводя серию экспериментов с афинными реагентами, она установила, что между центрами существует взаимосвязь: от того, занят один из них аминокислотой, тРНК, АТФ или нет, зависит поведение другого. Все эти данные в настоящее время тщательно изучаются.
— Работа, начатая молодыми учеными, продолжается, — говорит академик Д. Г. Кнорре. — Предстоит решить ряд проблем, е частности, каков характер взаимодействия центров, как происходит управление их работой и т. д. Но главное — ребятам удалось создать полный набор афинных реагентов — инструментов, с помощью которых мы сможем проникнуть в тайну работы фермента.
Химические инструменты использовал в своих экспериментах и москвич Игорь Мадоян. Он также изучал механизм работы фермента триптофан-тРНК-синтетазы, состоящего из двух субъединиц — двух одинаковых половинок. Подсоединяя к одной из них афинный реагент, исследователь целенаправленно изменял структуру фермента (в биохимии это называется «портить фермент») и наблюдал, как менялись его функции. В результате проведения серии экспериментов Мадояну удалось установить чрезвычайно интересный факт: субъединицы, не связанные между собой химической связью, оказывается, действуют согласованно: когда одна функционирует, другая «отдыхает». Фермент, таким образом, работает по принципу двухтактного двигателя. Эта модель принята ведущими биологами не только s нашей стране, но и за рубежом.
«Внерибосомный этап реализации генетичесного кода» — так называется работа, за которую шесть молодых ученых из Москвы и Новосибирска получили премию Ленинского комсомола 1984 года. Сергей Берестень, Малик Нурбенов и Игорь Мадоян проводили работу в Москве, в Институте молекулярной биологии АН СССР, Евгений Невинский, Нина Моор и Инна Горшкова — в Новосибирском институте биоорганической химии СО АН СССР. Все шестеро завершили свои исследования защитой кандидатских диссертаций. Объект изучения — ферменты, вещества, без которых в живой клетке не проходит ни одна химичесная реакция.
Я убеждаюсь, что дождался часа.
Когда природы тайную печать
Нам удалось сознательно сломать
Благодаря пытливости привычной.
Гёте. «Фауст»Жизнь организма слагается из множества жизней различных клеток. Чтобы понять, как работают клетки, ученые стали «разбирать» их на составные «неживые» части — молекулы — и исследовать механизмы сложных биологических явлений на этом уровне.
Около 30 лет назад на стыке химии, физики и биологии возникла новая наука — молекулярная биология. Начальный этап ее развития был отмечен рядом блистательных открытий. Определение структуры и биологической функции дизоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), всех типов рибонуклеиновых кислот (РНК), рибосом (самых маленьких клеточных органелл), а также установление их роли в передаче генетической информации, открытие явления обратной транскрипции — синтеза ДНК на матрице РНК, выявление механизмов биосинтеза белков, структуры антител — главных защитников организма, биологический и химический синтез гена, в том числе человеческого, перенос генов из одного организма в другой, расшифровка химического строения большого числа индивидуальных белков, главным образом ферментов, а также нуклеиновых кислот — вот далеко не полный перечень достижений молодой науки. Сейчас в ее развитии наступил внешне спокойный период. Настало время углубленных исследований, проникновения а самые потаенные уголки человеческого организма.
Самым сложным химическим процессом, происходящим в клетке, является синтез белков. Он происходит в рибосомах — «фабриках» белка. Производительности рибосом может позавидовать любой завод: за час они синтезируют белка больше, чем весят сами. Сюда образующаяся на ДНК так называемая «матричная» РНК (мРНК) приносит из ядра клетки генетическую информацию, которую с нее, как с магнитофонной ленты, считывает еще одна РНК — «транспортная» (тРНК). Она приходит в рибосому, чтобы руководить сборкой белка, причем с ней предварительно соединяется определенная аминокислота. Если последняя «ошибется» и соединится не со «своей» тРНК, синтез белка пойдет по неверному, запрограммированному пути. Из 20 тРНК, существующих в клетке, аминокислота «выбирает» нужную ей с помощью фермента — синтетазы. Он не только «узнает» тРНК, но и способствует ускорению реакции соединения с ней аминокислоты в сотни тысяч раз, то есть выступает в роли катализатора. Этот процесс, происходящий в цитоплазме клетки и называемый внерибосомным этапом передачи генетического кода, с момента зарождения молекулярной биологии является одним из главных объектов исследований ученых. В последнее время особое их внимание сосредо-
точено непосредственно на ферментах, выявлении механизма действия, а также структуры этих сложных биополимеров.
— Познав, как работают ферменты, — поясняет руководитель новосибирской группы лауреатов, академик Дмитрий Георгиевич Кнорре, — мы научимся использовать их для проведения реакций, которых нет в природе, а на этой основе сможем создавать новые химические производства.
Москвичи и новосибирцы исследовали именно эти ферменты-синтетазы. То была совместная работа по совместной программе, во время которой шел активный обмен мнениями, идеями, научными материалами. Каждый ее участник отвечал за свой конкретный участок.
КОНСТРУКТОРЫ «ХИМИЧЕСКИХ ИНСТРУМЕНТОВ»
Известно, что на поверхности фермента, который является сложной белковой молекулой, имеются активные центры. В них к ферменту присоединяются различные вещества: в одном — тРНК, в другом — аминокислота, в третьем — аденозинтрифосфорная кислота (АТФ), которая при своем расщеплении поставляет энергию, необходимую для образования химической связи между первыми двумя веществами. Соединившись, тРНК и аминокислота уходят из фермента в рибосому, причем, как говорят биохимики, «не оставляя следов» на его поверхности — структура фермента совершенно не изменяется. В этом кроется главная причина того, что обнаружить, где находятся его активные центры, чрезвычайно трудно. Поиском их месторасположения занимались новосибирцы: Евгений Невинский, Нина Моор и Инна Горшкова. Для этой цели они сконструировали специальные химические инструменты — синтезировали так называемые афинные реагенты, вещества, сходные по структуре и свойствам с природными биополимерами, например с тРНК или аминокислотой, но имеющие в отличие от них в своем составе какую-либо химически активную группу. Подобные реагенты можно получить либо непосредственно из природных веществ, присоединив к ним такую группу, либо создать новое химическое соединение — «двойника» природного, чтобы фермент не принял его за «чужака». Молодые исследователи синтезировали десятки подобных реагентов, использовали их для изучения механизма работы ферментов, в частности для обнаружения активных центров. Поскольку фермент по своим свойствам и структуре очень незначительно отличается от других находящихся в клетке белков, его невозможно изучать непосредственно в ней, а значит, надо выделить в чистом виде. Для этого применялись известные в настоящее время методы. Сначала клетки разрушали путем очень тщательного измельчения тканей, переводили фермент в раствор, а последний очищали с помощью электрофореза (способ, основанный на одном из важнейших свойств белковых молекул — наличии на их поверхности электрических зарядов), а также гель-фильтрации (просеивание через молекулярные сита).
 |
| Фермент аминоацил-тРНК-синтетаза (АРСаза) — для простоты он не разделен на две половинки — находит нужную аминокислоту (АК) и соединяет ее с определенной транспортной рибонуклеиновой кислотой (тРНК) с помощью молекулы аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ). |
Используя афинные реагенты, новосибирцам удалось установить, каким образом распределены активные центры одной из синтетаз, фермента, состоящего из двух субъединиц — двух цепей белковых молекул. На этом сложном ферменте Евгений Невинский обнаружил, помимо известных трех центров, еще один — регуляторный, управляющий их действиями. Каким образом он осуществляет свою регуляторную деятельность — предстоит решить в последующих работах.
Не менее интересное наблюдение сделала Инна Горшкова. Проводя серию экспериментов с афинными реагентами, она установила, что между центрами существует взаимосвязь: от того, занят один из них аминокислотой, тРНК, АТФ или нет, зависит поведение другого. Все эти данные в настоящее время тщательно изучаются.
— Работа, начатая молодыми учеными, продолжается, — говорит академик Д. Г. Кнорре. — Предстоит решить ряд проблем, е частности, каков характер взаимодействия центров, как происходит управление их работой и т. д. Но главное — ребятам удалось создать полный набор афинных реагентов — инструментов, с помощью которых мы сможем проникнуть в тайну работы фермента.
 |
| Молодые ученые Новосибирского института биоорганической химии СО АН СССР предложили на модели сложного фермента синтетазы, состоящего из 4 субъединиц — 2а и 2 схему расположения центров связывания аминокислоты (АК), аденозин трифосфорной кислоты АТФ (Аррр ) и тРНК. Аминокислоты (АК) и АТФ (Аррр) связываются с а субъединицей молекулы синтетазы, тогда как тРНК с Р субъединицей. |
НЕ «КЛЮЧ И ЗАМОК», А «РУКА И ПЕРЧАТКА»
Каким образом взаимодействуют тРНК и синтетаза, как фермент «находит» нужную аминокислоту, чтобы соединить ее со своей тРНК? Этой проблемой занимался Сергей Берестень. Он расщеплял относительно простыми ферментами (нуклеазами и протеазами) тРНК и синтетазу до и после их соединения в комплекс. Оказалось, что характер и скорость расщепления чистых веществ и образованного из них комплекса различны. Подобное явление можно было объяснить тем, что при соединении тРНК и синтетаза претерпевают взаимные конформационные изменения, то есть меняется их пространственная структура. А следовательно, распространенное до этого в молекулярной биологии представление о том, что тРНК и фермент структуры жесткие и при образовании комплекса подходят друг к другу, как ключ к замку, не совсем верно. Спектральный анализ подтвердил это. Молодой ученый впервые дал подробное описание процесса соединения указанных веществ: они как бы обволакивают друг друга, при этом тРНК «входит» в фермент, как рука в перчатку. Перчатка до того, как ее надели, не слепок с руки. Только когда ее натягивают на руку, она принимает ее форму. То есть здесь сохраняются требования пространственного соответствия (у перчатки должны быть пальцы), но к ним добавляется новая возможность изменения белковой структуры.
Подобную гипотезу выдвигали до Берестеня многие ученые, однако она не имела достаточно веских доказательств. Сергею удалось их получить. Его работа — пример так называемых «исследований в глубь проблемы», которые, как мы уже говорили, характерны для нынешнего этапа развития молекулярной биологии.
ИДЕЯ, ПОДТВЕРЖДЕННАЯ ЭКСПЕРИМЕНТОМ
То, что ионы металлов входят в состав ферментов, известно очень давно, но лишь в конце 70-х — начале 80-х годов их обнаружили в синтетазах, выделенных из бактерий. Цель работы Малика Нурбекова состояла в том, чтобы выяснить, есть ли ион металла в ферменте трип-тофанил-тРИК-сиінтетезе и, если он там есть, каков он, каковы его функции.
 |
| Фермент состоит из двух одинаковых половинок — двух субъединиц, которые при работе влияют друг на друга. Когда одна половинка присоединяет аминокислоту, другая «отдыхает», и наоборот. По-видимому, для фермента такой принцип работы наиболее целесообразен, так как обеспечивает достаточную скорость реакции и ее высокую точность. |
Существует несколько способов обнаружения ионов металлов в биологических объектах. Наиболее совершенным считается разработанный в 60-х годах метод пламенной
спектрофотометрии. Он заключается в следующем: готовится набор растворов ионов разных металлов. Они сжигаются ори температуре 2000е, а затем с помощью спектрофотометра из спектра пламени выделяются линии, соответствующие ионам того или иного металла.
Сжигая исследуемую синтетазу и изучая спектры (это была целая серия экспериментов), Нурбеков обнаружил в них линию поглощения цинка. Какова же его роль в ферменте?
Для того чтобы ответить на этот вопрос, нужно было «вырвать» ион цинка из молекулы фермента и посмотреть, как изменяются свойства последнего. Малик воспользовался веществом, которое избирательно связывает этот ион; ортофенантролином, органическим соединением, обладающим большим сродством к иону, чем фермент, сильнее притягивающим его к себе. Будет ли «бесцинковый» фермент выполнять функцию катализатора? Нурбеков предполагал, что нет, «о это требовалось доказать. Эксперимент был тщательно разработан, К ферменту добавлялся раствор, состоящий из тРНК, АТФ, а также радиоактивной аминокислоты. Затем из раствора выделяли тРНК в чистом виде (для этого ее осаждали на нитроцеллюлозном фильтре, который избирательно задерживал тРНК). При исследовании фильтра оказалось, что он не радиоактивен. Стало быть, фермент не «сработал» — не соединил тРНК с радиоактивной аминокислотой, потерял свои каталитические свойства.
 |
| При образовании комплекса тРНК-синтетаза наблюдаются взаимные конформационные изменения обоих партнеров — их соединение происходит по типу «рука-перчатка», что приводит к появлению активного комплекса, а это, в свою очередь, обусловливает соединение с помощью фермента аминокислоты и тРНК. Фермент для простоты не разделен на две половинки. |
Почему же активность фермента зависит от присутствия в нем ионе металла? В поисках ответа на вопрос Нурбеков исследовал с помощью дихрографа (прибора, измеряющего Спектр различных веществ) раствор синтетазы с ионом металла и без него (по спектру можно судить и о пространственной структуре вещества). Оказалось, что у фермента, потерявшего ион, меняется структура и он перестает действовать как катализатор.
Работы, о которых мы рассказали, относятся к разряду так называемых «пробирочных».
 |
| При удалении иона цинка из фермента активность последнего резко понижается, при возвращении иона цинка она восстанавливается. |
— Это типичные фундаментальные исследования, — говорит руководитель московской группы лауреатов, лауреат Государственной премии СССР, профессор Лев Львович Киселев. — Но, как говорится, нет ничего практичнее хорошей теории. Когда Беккерель открыл радиоактивность, кто думал, что лет через пятьдесят будут строить атомные электростанции. Работы лауреатов значительно дополнили наши представления о ферментах и имеют несомненное значение для дальнейшего развития этой области молекулярной биологии. Общетеоретические достижения молекулярной биологии будут все шире использоваться в медицине, химии, в технологии полимерных материалов, разработке эффективных средств борьбы с онкологическими и вирусными заболеваниями, в новых технологических схемах с использованием ферментов, синтезе больших количеств белков для применения в сельском хозяйстве и пищевой промышленности и в решении многих других важных практических проблем.
Комментариев нет:
Отправить комментарий